深夜，一個宮女在一名太醫掩護下，偷襲了雍正的寢宮，使其雍正暴死，人頭丟了，下葬時用一顆金頭代替。　　乾隆繼位，立即多方秘密追查刺殺雍正之人。幾番搜查之后，雍正時期文字獄的最大冤主呂留良家族的唯一活口呂四娘(袁詠儀 飾)被認為正是割走雍正人頭之人。(呂四娘從文字獄案逃脫后被江湖上大名鼎鼎的獨臂神尼收為徒弟習武，長大后本事甚為了得。)乾隆嚴命“雍正無頭案”不得走漏半點風聲，并秘命內廷四大侍衛南下追捕呂四娘。其中領頭者為一等侍衛伊爾根。　　呂四娘其時正和太醫曹太虛(袁祥仁 飾)奔走在南方的某個小城里，行醫賣藝。雍正晚年崇尚金石之術時，曹太虛原是皇上身邊的方士之一。乾隆對此案志在必得，又派特使快馬加鞭傳旨到南少林，要南少林派人暗中密查呂四娘和曹太虛下落，追回雍正的人頭。特使找到南少林的老主持玄通大師，將皇上御賜的龍牌交與他，憑龍牌行事，不得有誤。　　此時南少林寺內正在熱火朝天準備一次三十六房主持的競選，這次競選意義非同一般：誰當上三十六房主持，就成為南少林武功第一，也就是半個中國武功第一。寺內上下都明白最有實力者非方世玉(吳京 飾)與云明(淳于珊珊 飾)二人莫屬。　　特使提議誰最后成為勝出者，誰就可持龍牌抓人。但玄通明白按照比武規則，世玉和云明進入最終對決必有一死一傷，而且也延誤圣命。玄通斷然宣布，二人比試南拳七十二式點到為止，誰勝出誰就能憑著龍牌去執行朝廷交給的任務。云明自知武功稍遜世玉，本想在最后的比試中做手腳陷害世玉，以奪得主持之位。面臨突然的變動，他順水推舟，干脆在比試中敗在世玉手下。他更想趁此機會，在世玉追查呂四娘行蹤的途中殺死世玉，并栽贓給呂四娘。這樣他可穩當坐上三十六房主持之位。　　方世玉邀請兩位老朋友——“江湖老千”卓靈(宋妍 飾)和“神偷”趙大宏(在第一部中本說到大宏已死，但世玉等人發現棺木里是空的，大宏死而復生。疑是三德(晉松 飾)和尚營救了大宏)一起踏上征程。世玉的恩師、三十六房的創始人三德和尚早已被逐出南少林，得知世玉接受朝廷指派任務出行的消息后，悄悄跟隨世玉一行，暗中相助。　　泉州知府溫榮玉(徐鳴 飾)綽號“玉老虎”，與云明勾結，欲在途中加害方世玉。原來他與云明都知曉世玉身上的一個秘密，那便是刺在他背上的一張“藏寶圖”。明朝正德年間，倭寇在南少林寺后山埋下了一批珍寶，價值連城。悉知此事的三德和尚將藏寶的地圖刻在世玉的后背上，沒有留下任何副本。所以殺了世玉，云明可得主持之位，玉老虎可拿著人皮地圖起獲珍寶。一舉兩得的事情，唯有聯手勝算最大。南少林三十六房劇照　　云明和玉老虎想從世玉身邊的親密朋友下手，于是設計欲買通卓靈和趙大宏。卓靈和趙大宏知道了寶藏圖，卻瞞著對此事不知內情的世玉，打起了自己的算盤：好東西干嗎不自己留著?　　另一方面，三德和尚此次跟隨世玉的主要目的也是為了保護寶藏圖不落人他人之手——其實他并非真正被逐出少林，而是由玄通大師暗中安排在寺外接應南少林，并保護這批珍寶。　　世玉一路喬裝打扮，和卓靈、趙大宏尋訪呂四娘下落，終于在三德的暗中幫助下發現了呂四娘和曹太虛的行蹤。呂四娘與世玉幾次交手，被世玉的蓋世氣質所征服，芳心萌動。世玉也對呂四娘有好感，并和卓靈分析呂四娘可能是被人陷害。卓靈見世玉偏袒女殺手，大為吃醋。