1999年，于小偉考入中央戲劇學院。2000年，參演徐帆主演的電視劇《永遠有多遠》，這是他的首部電視作品。
2003年4月，參演陸毅、林心如主演的電視劇《男才女貌》，飾演高富帥“劉浩東”。2005年，在顧長衛導演的電影《孔雀》中扮演張靜初的暗戀對象、解放軍傘兵；參演蔣雯麗，那英，羅海瓊主演的都市愛情片《好想好想談戀愛》；12月，在陳凱歌導演的東方奇幻史詩電影《無極》中飾演也力一角。
2008年3月，參演的范冰冰、霍建華、劉雪華主演的電視劇《胭脂雪》播出，出演軟弱在感情上左右搖擺的辜少棠，被香港媒體評為2008年度香港最具人氣的大陸男演員。
2012年3月，與韓雪、丁子峻主演電視劇《偏偏愛上你》，飾演林重光；6月，于小偉與鄔君梅、羅家英等主演驚悚片《查無此人》，榮獲第四屆英國萬象國際華語電影節“優秀新人演員獎”。
2013年5月，與薩日娜、閆學晶領銜主演的電視劇《闖關東前傳》播出，飾演管家大哥管糧；5月29日，與佟大為、于明加、丁嘉麗、周曉歐等聯合主演的反應現代門第觀念下婚戀矛盾的電視劇《門第》在安徽衛視、河南衛視、深圳衛視、四川衛視黃金檔播出，于小偉在劇中飾演玩世不恭、冷漠孤傲、自私自利的“冷面貴公子”羅勝利。
2014年3月，主演《食來孕轉》播出，于小偉與劉濤在劇中分別飾演杜一鳴和沈谷雨